ПЦР-диагностика. Что это?
ПЦР-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования,широко применяющийся в диагностике инфекционных заболеваний. ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции).На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики.На базе клинической лаборатории создана ПЦР- лаборатория. ПЦР (полимеразная цепная реакция) -метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций "золотым стандартом". Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллиона других молекул. В настоящее время этот один из наиболее современных и совершенных лабораторных методов диагностики с успехом применяется при исследованиях специалистами клинической лаборатории СПбГУЗ"ГСПК".
ПЦР — (Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) - расшифровывается как полимеразная цепная реакция.
ПЦР диагностика — это метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, в частности, этот метод широко применяется и для диагностики заболеваний, передающихся половым путем.Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции. «Небольшой фрагмент ДНК» — это несколько сотен пар оснований ДНК , расположенных в строго определенной последовательности.Для ПЦР-диагностики инфекций достаточно небольшого фрагмента, поскольку любая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований.При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма. Это значит, что этот фрагмент ДНК «особенный» — он встречается только у этого микроба (или группы родственных микробов), но не встречается ни у одного другого микроба.Сама полимеразная цепная реакция (пцр диагностика) используется для того, чтобы найденный фрагмент размножить, клонировать: чтобы однозначно «увидеть» эти фрагменты ДНК, к окончанию реакции их должно быть не мене 1012 штук.
История открытия ДНК и разработки метода ПЦР
Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента — он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы — 72оС. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре.
В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.
Ежегодно появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека.Официальное становление метода ПЦР в России связано с выходом в 1995 г. двух методических рекомендаций: "Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции", в них ПЦР впервые рекомендована к применению в практическом здравоохранении; "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции". В 1995 г. была впервые подготовлена техническая документация (инструкции, технические условии.) и зарегистрирован в Минздраве России отечественной набор реагентов для ПЦР-диагностики. За прошедшие годы появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: мультипраймерная ПЦР, гнездовая ПЦР, ПЦР in situ, ПЦР в режиме реального времени . Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность и специфичность.
Изучение ДНК: строение, структура ДНК
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - универсальный носитель генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов. Открытие ДНК молекулы произошло в 1953 году. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК, их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией.ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из из последовательно соединенных нуклеотидов. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться (реплицироваться).В построении новой цепи активным "строителем" выступает специальный фермент - ДНК-полимераза. Из одной молекулы ДНК образуются две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная. В основе анализа методом ПЦР лежит принцип репликации ДНК - синтеза ДНК, который современным ученым удалось воссоздать искусственно: в лаборатории врачи вызывают удвоение небольшого фрагментаДНК. Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, другие биологические выделения, биоптаты.Забор материала производится в условиях процедурного кабинета лаборатории соответствующего профиля. После забора пробы вскоре должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию \ Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. \ В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки. Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена.
Количественная оценка результатов ПЦР
В ряде клинических ситуаций возникает вопрос о динамике патологического процесса и/или эффективности проводимой терапии. Эти вопросы наиболее актуальны при обследовании пациентов с хроническими инфекциями (гепатиты В ,С, вирус иммунодефицита человека Все большее развитие получает лабораторная диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) благодаря своей скорости и высокой чувствительности.
Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:
Прямое определение наличия возбудителей.
Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
Высокая специфичность.
Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.
Высокая чувствительность.
Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).
.Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.
Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.
Высокая скорость получения результата анализа.
Для проведения ПЦР- анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов 6.Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитарных агентов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды.В настоящее время метод ПЦР-диагностики интенсивно развивается. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа.Диагностика инфекционных заболеваний является наиболее частым приложением ПЦР в медицинских учреждениях. Наиболее востребована ПЦР-диагностика вирусов (главным образом, вирусов гепатитов В и С, а также группы герпеса), а также возбудителей скрытых инфекций, передающихся половым путем (хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.).
ПЦР в диагностике инфекционных болезней
Определить этиологию инфекции (т.е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например,Mycoplazma genitalium, ПЦР – это единственный метод диагностики на сегодняшний день.Определить количество возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов,которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами.
ПЦР в диагностике гепатитов.
В настоящее время известно как минимум 5 вирусов, способность которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. В редких случаях гепатит может быть вызван вирусом Эпштейна-Барр, вирусом простого герпеса. Способность поражать печень таких агентов как вирус ТТ, вирус гепатита G сегодня признается не всеми. Все вышеперечисленные вирусы относятся к различным семействам, имеют разные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита.
Вирусный гепатит А (ВГА): ПЦР используется для обследования контактных лиц и более раннего выявления заболевших гепатитом В крови больного гепатитом А вирус присутствует гораздо дольше (иногда до нескольких месяцев), т.е. возможность заражения гепатитом А через кровь не ограничивается вышеуказанными сроками, и ПЦР единственный метод, с помощью которого возможно осуществлять мониторинг вирусемии (наличия вируса в крови)
Вирусный гепатит В (ВГВ): в диагностике вирусного гепатита В ПЦР имеет свои неоценимые достоинства:
Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:
Установить факт инфицированности гепатитом С. Это важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК , и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС(при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС. Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так, наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.
Диагностика вирусных гепатитов
Гепатит А вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита А (HAV)
В крови для диагностики определяют:
anti-HAV-IgM - aнтитела к вирусу гепатита А класса IgM – маркер острой инфекции вирусом гепатита А
anti-HAV-total - aнтитела к вирусу гепатита А суммарные классов IgM и IgG
Гепатит В вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита В
В крови для диагностики определяют:HВsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В – основной маркер вирусного гепатита В или вирусоносительства;HBeAg - Hbe антиген вируса гепатита В – маркер активной репликации (размножения) вируса в органинизме;Anti-HBs - антитела к HBs антигену вируса гепатита В – маркер защитного иммунитета против вируса гепатита В, определяются также после вакцинации; Anti-HBc-total - антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В суммарные классов IgM и IgG – маркер перенесенного или текущего гепатита В;Anti-HBc IgM - антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В класса IgM – маркер острого процесса; Anti-HВe - антитела к Hbeантигену вируса гепатита В – маркер перенесенного острого гепатита В, маркер ремиссии; ДНК вируса гепатита В качественное и количественное определение методом ПЦР
Гепатит С вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита С (HСV)
В крови для диагностики определяют
anti-HСV-total - aнтитела к вирусу гепатита С суммарные классов IgM и IgG – маркер инфицирования вирусом гепатита С (перенесенного или текущего)
РНК вируса гепатита С качественное и количественное определение методом ПЦР
Генотипирование вируса гепатита С – для определения тактики и эффективности лечения, прогноза на будущее
Гепатит D вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита D (HDV)
Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.
Гепатит G вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита G (HGV)
Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.
Гепатит TT вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита TT (TTvirus)
Для диагностики применяется качественное определение ДНК вируса методом ПЦР в крови.
ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции.
В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход - обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) –anti-HIV с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ.Практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением.Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес.Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.